Бактек для диагностики туберкулеза

Характеристика питательной среды, используемой в пробирке MGIT

Содержимое пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7H9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка BACTEC MGIT Growth Supplement OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Она крайне важна для роста многих микобактерий, особенно бактерий, принадлежащих к группе M. tuberculosis. Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA.

Принципы детекции и постановки тестов на лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам

Кроме жидкой среды Мидлбрук 7H9, в пробирке MGIT содержатся: бескислородный флюорохром, трис – 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин пентагидрат хлорида рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC 960. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируете в единицах роста (GU – growth units).

Пробирки MGIT инкубируются при температуре 37°C с последующим анализом, осуществляемым вручную при ультрафиолетовом излучении, либо путем помещения в прибор MGIT 960, где пробирки проходят инкубацию и мониторинг степени флюоресценции каждые 60 минут. Рост микобактерий и других бактерий вызывает усиление флюоресценции. В случае с M. tuberculosis в момент положительного посева пробы наблюдается около 105-106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1мл среды. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня). Рост бактерий также может быть определен визуально в случае неоднородности и/или помутнения среды либо наличия в ней грануловидных или хлопьевидных вкраплений. Рост некоторых нетуберкулезных микобактерий (большинство из них обладает быстрым ростом) приводит к легкой замутненности, в то время как бактерии, вызывающие контаминацию, обычно вызывают выраженную мутность среды.

В основе теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулеза – в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для проведения теста используются специальные держатели для 2, 3, 4, 5 и 8 пробирок. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат – контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке. Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным микобактериям, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флуоресцентности в данной пробирке будет выраженнный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960, который автоматически интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату.

Результаты и отчетность

Если в инокулируемой пробе присутствуют жизнеспособные микобактерии, они растут в питательной среде и обнаруживаются визуально, а также при помощи флюоресценции. О результатах сообщается только в том случае, если пробирка MGIT определена прибором как положительная и мазок, взятый из этой пробирки, также положителен на КУМ. В редких случаях пробирка MGIT может быть определена прибором как отрицательная, при этом мазок может быть положительный.

В таком случае сообщается о положительных результатах. Отчеты необходимо отсылать сразу после готовности результатов. Если идентификация требует дополнительного времени, о результатах можно сообщить как о культурах, положительных на КУМ, ожидающих идентификации. Предпочтительнее идентифицировать комплекс M. tuberculosis молекулярным зондом, при возможности, или другими экспресс-методами; о результатах сообщать сразу после идентификации.

Отчеты о негативных культурах составляются после получения протокола исследования и визуального осмотра негативных пробирок. Контаминированные культуры регистрируются после подтверждения мазком и субкультивированием на кровяном агаре.

a. Мазок из пробы (флюорохромное окрашивание или метод Циль-Нильсена) – сообщается о положительном либо отрицательном результате и об использованном методе окрашивания. (В течение 24 часов после получения пробы, по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний, отчет нужно предоставить).

b. Культура: положительная (подтверждение – мазок на КУМ). Желательно, после выполнения идентификации – комплекс M. tuberculosis или MOTT bacilli (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний сообщить в течение приблизительно 14 дней). В дальнейшем идентифицировать микобактерии и составить отчет.

c. По завершении теста на лекарственную чувствительность определяется выявлена ли чувствительность или резистентность к каждому исследуемому препарату и сообщается в течение 28 дней (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний).

d. Культура: отрицательная после подготовки протокола об инкубации (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний в течении 42 дней).

По данным исследований, с использованием жидких сред, как правило, вырабатывается больше положительных культур, чем при использовании плотных сред, при этом имеет место значительное сокращение времени выявления положительного роста. Данные многочисленных сравнительных исследований производительности BACTEC MGIT 960, BACTEC 460 TB и обычных плотных сред представлены на научных конференциях и опубликованы в журналах.

Недостатки метода

a. Невозможность наблюдения структуры и окрашивания колонии в жидкой среде.

b. Если в процессе деконтаминации и ингибирования добавкой PANTA остается хотя бы одна живая контаминирующая бактерия, она может вызвать заражение всей среды. Контаминация может скрыть рост микобактерий.

c. Положительную культуру из клинической пробы невозможно соотнести с колониеобразующими единицами (КОЕ), присутствующими в пробе – иногда это используется для определения важной нетуберкулезной инфекции.

d. Пробирка MGIT, кажущаяся положительной, может содержать смесь культур более одного вида микобактерий. Микобактерии с более быстрым ростом могут вызвать положительную флуоресценцию раньше медленнорастущих микобактерий. Поэтому в случае признаков наличия более одного вида микобактерий в мазке на КУМ, взятом из культуры, большую роль играет субкультивирование положительной пробирки MGIT на агарной пластинке Мидлбрука.

e. Иногда высокая конечная рН пробы может вызвать ложную кратковременную флуоресценцию датчика.

f. Смесь антибиотиков PANTA, необходимая для подавления контаминирующих бактерий, может также оказывать ингибирующий эффект на некоторые виды микобактерий помимо комплекса M. tuberculosis. Подобное ингибирование различно у разных видов бактерий и происходит в рамках одного вида. Однако общее выделение нетуберкулезных бактерий достигается на более высоком уровне в жидкой среде, нежели в плотной.

Тесты на лекарственную чувствительность к препаратам первого ряда: стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол (SIRE)

Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам имеют исключительную важность для назначения эффективного лечения, особенно в случаях обнаружения лекарственной резистентности к противотуберкулезным препаратам. Они также важны для последующей коррекции антибактериальной терапии, в случае ее неэффективности.

Тест на чувствительность к препаратам – стрептомицину (S), изониазиду (I), рифампицину (R) и этамбутолу (E), сокращенно SIRE, проводимый при помощи прибора BACTEC MGIT 960, представляет собой быстрый и качественный метод определения чувствительности M. tuberculosis к четырем указанным лекарственным средствам в критически допустимых концентрациях. Кроме того, при необходимости можно проводить тесты с высокой концентрацией стрептомицина, изониазида и этамбутола.

Принципы проведения теста

Культуры, выделенные от пациентов, больных туберкулезом, выращиваются с добавлением известной концентрации тестового лекарственного препарата. Также используется контрольная пробирка без добавления лекарственного средства. Если изолят больного растет на контрольной пробирке, но не растет в среде с добавлением лекарственного препарата, он определяется как чувствительный к данному препарату. С другой стороны, если он растет в обеих пробирках, тем самым устанавливается его резистентность к указанному препарату.

Существуют несколько методов проведения теста на чувствительность, самый распространенный – метод пропорций. В таком методе резистентность для большинства лекарственных средств устанавливается на уровне 1 %. Это означает, что если общая тестируемая бактериальная популяция 1 % или более резистентна к лекарственному средству, она считается резистентной в клинических целях. На протяжении длительного времени в методе пропорций используется плотная агаровая среда Мидлбрук. После 3-4 недель инкубации для определения резистентности на среде, содержащей лекарственный препарат, подсчитывается процент колоний по сравнению со средой, в которой отсутствуют лекарственные препараты.

В 1980 г. был внедрен метод пропорции на основе бульона, известный под названием – радиометрический тест на чувствительность BACTEC 460 TB. В этом методе используется радиометрическая среда BACTEC 12B с субстратом класса C14.

Бактериальный инокулят в контрольном образце в 100 раз меньше инокулята в содержащей лекарственный препарат среде. CO₂, образующийся во время роста и метаболизма микобактерий в такой среде, измеряется и обозначается как индекс роста (Growth Index – GI). Как только GI в контрольном образце достигает значения 30 (обычно после 4-6 дней инкубации – максимум 1 2 дней), сравнение показателей GI в содержащей лекарственный препарат среде и не содержащей его является основой пропорции резистентности.

Тест на чувствительность с использованием BACTEC MGIT 960 был внедрен на основе аналогичных принципов, при этом увеличение флуоресценции в датчике измеряется автоматически и обозначается как значение роста (Growth Value – GV).

Если лекарственный препарат добавляется в среду, обладающую бактериостатическими или бактерицидными свойствами по отношению к тестируемым микобактериям, он ингибирует рост, таким образом, кислород поглощается либо в малых количествах, либо не поглощается совсем, поэтому отсутствует флуоресценция датчика. Результаты теста на лекарственную чувствительность, полученные при использовании системы BACTEC MGIT 960, идентичны данным, получаемым при помощи системы BACTEC 460TB, длительность исследования также примерно одинаковая. Концентрации лекарственных препаратов в тесте на чувствительность SIRE с использованием BACTEC MGIT 960 несколько ниже, чем в методе пропорций на плотной среде (во избежание ложных результатов чувствительности).

Тест на чувствительность BACTEC MGIT 960 был подвергнут детальной оценке путем сравнения со средой Мидлбрук 7H10, а также с системой BACTEC 460 TB System.

Тесты, применяемые при более высоких концентрациях лекарственных препаратов

Рекомендуется всегда тестировать лекарственные препараты ряда SIRE в критических концентрациях. Однако в некоторых ситуациях показано тестирование при более высокой концентрации. Оно играет роль для изолятов, имеющих низкий уровень резистентности, т.е. изолят проявляет резистентность при предельной концентрации, но чувствителен к высокой концентрации препарата. Поэтому во многих лабораториях сначала проводится тест при критической концентрации препарата, и в случае резистентности изолята он тестируется при высокой концентрации.

При высоких концентрациях тестируют только стрептомицин, изониазид и этамбутол. Из трех данных препаратов изониазид наиболее важен, поскольку врачи-клиницисты могут посчитать необходимым продолжить использование изониазида в терапевтическом режиме, если выделенная культура пациента резистентна при критической концентрации и чувствительна при высокой концентрации (т. н. “резистентность низкого уровня”). В продаже имеются указанные высокие концентрации стрептомицина, изониазида и этамбутола для BACTEC MGIT 960.

Конечная концентрация препарата в среде должна быть следующей:

• стрептомицин 4,0 мг/мл среды
• изониазид 0,4 мг/мл среды
• этамбутол 7,5 мг/мл среды

Учет результатов

По завершении теста (4-21 день) на приборе появится сообщение о готовности результатов. Необходимо просканируйте штрих-код держателя и распечатать отчет. В распечатке прибора указаны результаты теста на чувствительность к каждому лекарственному препарату. Результаты имеют качественный характер: чувствительный (S),резистентный (R), либо результат теста не определен (X).

Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). В этот момент оцениваются показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом.

S-чувствительный – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет менее 100.

R-резистентный – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более.

X-ошибка – неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые могут повлиять на процедуру теста, например, при достижении единицей роста контрольного образца величины ?400 менее чем за 4 дня. В подобных случаях тест необходимо повторить с чистой, активнорастущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis. Некоторые лекарственноустойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо также повторить исследование.

Анализатор бактериологический BD Bactec™ MGIT™ 960

1. автоматизированная модульная система (наличие 3 секций) для тестирования и системы контроля культур, предназначенная для in vitro диагностики микобактерий из клинических образцов: мокроты, промывные воды бронхов, плеврального экссудата, синовиальной и церебральной жидкостях и определения чувствительности микобактерии к лекарственным препаратам 1 ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид);

2. автоматическое, постоянное тестирование культур с использованием неинвазивной и нерадиометрической технологии. Периодичность измерений инкубируемых пробирок – 1 раз в час.

3. забор и обработка образцов в специальных пробирках объемом 7 мл;

4. наличие фотодетектора в приборе, измеряющего уровень флуоресценции в зависимости от количества кислорода, потребляемого микроорганизмом в процессе роста, производящего считывание результатов каждые 60 секунд;

5. возможность регистрация положительной культуры посредством светового индикатора на передней панели секции, включением звукового сигнала, а также указание номера станции с отображаем его на жидкокристаллическом дисплее;

6. возможность одновременного тестирования 960 проб на наличие в среде микобактерии туберкулеза;

7. время детекции микобактерий от 5 до 14 дней;

8. среднее время определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам – 7-9 дней;

9. максимальный протокол исследования на детекцию не более 42 дня;

10. максимальная продолжительность исследования лекарственной чувствительности – не более 28 дней

11. наличие бар-код сканера для сканирования штрих кода пробирки при ее идентификации;

12. наличие флоппи диска для обновления программного обеспечения и сохранения данных для диагностики системы и корректировки ошибок;

13. наличие системного компьютера в верхней секции прибора для контроля позитивности пробирок, контроля системы, сохранения данных и интерфейса пользователя;

14. наличие внешнего порта на задней панели для соединения с принтером;

15. наличие системного программного обеспечения, отображающего все функции, операции и установочные параметры;

16. наличие встроенного программного тестирования для постоянного контролирования работы электрической и оптической составляющих всех детекторов одновременно. Данная функция позволяет проводить автоматический мониторинг основных операционных характеристик каждого детектора;

17. возможность автоматической калибровки системы.

Bactec MGIT 960 – автоматизированная модульная система предназначена для in vitro ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза на исследование различных биологических жидкостей организма:

• мокроты;
• промывные воды бронхов;
• плеврального экссудата;
• синовиальной и церебральной жидкостях.

Образцы забираются, обрабатываются и инокулируются в специальные пробирки BBL MGIT объемом 7 мл.

Прибор одновременно проводит тестирование в 3 рабочих секциях на наличие в среде микобактерии, каждая секция вмещает 320 пробирок, в которых проводится постоянная инкубация.

Регистрация роста микроорганизмов осуществляется оптически. В ее основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода в процессе роста микобактерий. Кислород-зависимый флюорохромный краситель содержится на дне пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к потреблению кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиком, встроенными в прибор Bactec MGIT 960. Прибор непрерывно автоматически тестирует пробирки. Ряд светодиодов, находящихся под пробирками, активирует флуоресцентный сенсор, а фотодетекторы прибора производят считывание результатов (каждые 60 минут). Регистрация положительной культуры немедленно сигнализируется прибором посредством светового индикатора на передней панели секции, включением звукового сигнала, а также номер станции отображается на жидкокристаллическом дисплее.

Бар-код сканер находиться на передней панели прибора и предназначен для сканирования штрих кода пробирки при ее идентификации. Сканер включается автоматически при готовности системы к считыванию штрих кода.

Флоппи диск обеспечивает возможность обновления программного обеспечения и сохранения данных для диагностики системы и корректировки ошибок.

Системный компьютер находится в верхней секции прибора и предназначен для контроля позитивности пробирок, контроля системы, сохранения данных и интерфейса пользователя.

Внешние порты на задней панели прибора используются для соединения с принтером и для сервисных целей. Сетевой порт необходим для соединения с другими приборами.

Системное программное обеспечение представлено в виде упрощенного варианта интерфейса пользователя с иконками, отображающими все функции, операции, установочные параметры и состояния. Рутинные операции выполняются посредством нажатия функциональных клавиш соответствующих иконкам на экране.

Дисплей: экран появляется при всех закрытых секциях прибора. Суммарная область отображает число пробирок признанных позитивными, негативными, тестируемыми, доступными, а также анонимные станции, станции с ошибками и текущие время и дату. Функциональные клавиши позволяют выполнять установку параметров, выполнять рутинное ежедневное обслуживание, просматривать системные ошибки, получать отчеты и проверять температуру прибора.

Возможно управление параметрами работы (количество дней исследования, дата и время проведения анализа, температура инкубации, степень громкости звукового сигнала).

Возможно отображение текущей информации, параметров работы, положительных образцов.

Активные экраны: данный тип экрана появляется при открытии какой-либо секции прибора и позволяет вносить новые пробирки, удалять позитивные, негативные и тестируемые пробирки; идентифицировать анонимные пробирки и решать ошибки станций.

Основные преимущества оборудования BACTEC MGIT 960 является:

• автоматическое, постоянное тестирование культур с использованием неинвазивной и нерадиометрической технологии;
• минимальное участие лаборанта в управлении прибором;
• простой интерфейс Пользователя;
• выявление положительной культуры сигнализируется световым индикатором, жидкокристаллическим дисплеем и звуковым сигналом;
• пробирки изготовлены из пластика, устойчивого к повреждениям.

Физические параметры:

• Высота: 147,5 cm
• Ширина: 91,5 cm;
• Глубина: 76,0 cm;
• Вес (без пробирок): 342,0 kg;
• Вес (960 пробирок): 360,2 kg.

Электрические параметры:

• Входное напряжение: 220 V;
• Входной ток: 10 Amp max;
• Входная линия: 50 or 60 Hz +/- 3 Hz.

(Внимание: для инсталляции должна быть предоставлена линия- 15 Amp)

Условия эксплуатации:

• Температура: 19°C – 30°C;
• Влажность: 30% – 80% RH, не конденсирующийся;
• Расположение: прибор рекомендуется размещать на полу, избегать прямых солнечных лучей.